En la primera parte acabé mencionando las propiedades de los canales que simulan las resistencias del circuito eléctrico que forman las bicapas lipidicas de nuestras neuronas. Sin embargo, no se profundizó en el estudio de este «circuito» a partir de la electrofisiología. Por tanto, en esta entrada vamos a ahondar en lo más utilizado actualmente para ello: el patch clamp.

Técnicas utilizadas, contexto histórico & material necesario

No únicamente se utiliza la electrofisiología, sino que encontramos multitud de técnicas que se pueden combinar entre sí y complementarse unas a otras: desde colorantes fluorescentes hasta técnicas ópticas y biológicas. Por tanto, aunque en este artículo nos centremos en la electrofisiología, no olvidemos la importancia de mantener cierta perspectiva.

Ya en los años 30 se empezaron a utilizar electrodos eléctricos en células muy grandes como los axones gigantes que presentan los calamares. Gracias a ello, se observó el primer potencial de acción a partir de la introducción de una micropipeta con un electrodo fuera. A partir de este hito, se desarrolló posteriormente el voltage-clamp donde se intentaba fijar el voltaje para medir las corrientes presentes en la membrana. Con el tiempo, gracias a Neher y Sakmann, se evolucionó al estudio de canales únicos acercando electrodos más grandes cerca de la membrana sin atravesarla. Algo que seguimos conociendo como patch-clamp.

Aunque para este tipo de registros se puede utilizar tanto microscopios invertidos como «upright«, se suelen utilizar los primeros para facilitar la introducción de la pipeta. Sin embargo, para slices o cultivos primario, es necesario los invertidos para observar la capa del tejido superficial que será utilizada. Además del propio microscopio, tendremos una pipeta de registro y un amplificador conectado al baño que dará una señal analógica que deberá ser traducida en digital a partir de tarjetas digitalizadoras.

Como se trabaja de manera milimétrica, necesitaremos de mesas antivibratorias y jaulas de Faraday que aíslen la señal recibida conjunto micromanipuladores que permitan el correcto manejo de la pipeta. Por otro lado, para detectar las células de interés necesitaremos de un sistema de fluorescencia y sistemas de perfusión que provea del medio extracelular que necesitan. Por otro lado, las pipetas que necesitamos deberán fabricarse mediante un puller y, en caso de ser necesario, pulirlas con una microforja.

Patch Clamp

El concepto patch-clamp viene a reflejar una técnica basada en acercar una pipeta de vidrio a la membrana de estudio para formar un sello de una resistencia enorme que puede llegar a alcanzar los gigaohms.

Una vez formado esta conformación entre la membrana y la pipeta se pueden realizar registros en conformaciones diferentes:

• Cell-attached: Una vez realizado el sello, se pueden proceder a realizar registros single-channel.
• Whole-cell: Desde cell-attached se puede realizar una fuerte succión para romper la membrana de cara a registrar las corrientes de toda la célula.
• Outside-out: Desde whole-cell, si se estira la pipeta se extrae un trozo de la membrana para medir la actividad de canales controlando el medio intracelular o extracelular para aplicar fármacos desde un lado del canal. En este caso el trocito de membrana exterior quedaría expuesto al baño.
• Inside-out: Desde cell-attached, si se estira la pipeta se extrae un trozo de membrana para medir la actividad de unos pocos canales. A contrapartida del anterior, la cara interna de la membrana es la que queda expuesta al baño.

Dentro del concepto que entedemos como patch-clamp, encontramos dos modalidades bastamente utilizadas:

• Voltage-clamp. Se fija el voltaje para medir la corriente de iones a partir de un electrodo (o dos en caso de células muy grandes). La pipeta mantiene el voltaje constante a partir de ciclos de medición-inyección que nos permitirá saber la corriente. De hecho, la medida en pico-amperios que obtenemos es de manera indirecta a partir de la corriente que debe ser inyectada para que el voltaje no se modifique.
• Current-clamp. Principalmente nos sirve para medir el potencial de membrana y su excitabilidad fijando la corriente mediante un electrodo intracelular (electrodo fino) o en una configuración de whole-cell (electrodo grueso).

¿Cómo se realiza el sellado de la célula?

Para crear esta interacción entre la membrana y la pipeta, se puede utilizar la presión negativa a partir del holder que aguanta la pipeta. De hecho, a partir de pulsos de voltaje podemos comprender en que punto nos encontramos en todo momento.

La pipeta ante el aire no presentará corriente alguna por que es un gran aislante. Una vez en el baño, el pulso de voltaje que podemos realizar nos servirá tanto para determinar la resistencia de la pipeta (tamaño) como para saber cuando tocamos la célula ya que esta resistencia aumentará al entrar en contacto con la superficie y la corriente disminuirá. Sin embargo, seguirá habiendo paso de corriente que debemos disminuir aplicando succión para atraer a la membrana dentro de la pipeta de vidrio hasta formar un gigasello de alta resistencia.

Para realizar el whole-cell, aplicaremos una fuerte succión para romper la membrana. Si este proceso se realiza de manera correcta, aparecerán unos transcientes capacitativos al entrar en contacto con la membrana que actúa como aislante. De hecho, en función de estos transcientes podremos estimar la capacitancia de la célula que comentamos en el artículo anterior. Cuanto mejor este hecho el sello, más finos serán. Sin embargo, si el acceso eléctrico está comprometido, las amplitudes serán mucho más grandes. Importante destacar que para normalizar los datos, se utilizará esta capacitancia debido a que no es lo mismo medir la corriente de células de distinto tamaño.

Además, según el objeto de estudio miraremos de modificar las condiciones del ambiente. Por ejemplo, en caso de estar estudiando un canal de rectificación de salida necesitaremos controlar el potencial de membrana hacia rangos positivos. La farmacología también es altamente útil para bloquear canales que no son de interés o para estudiar la interacción con otros agonistas o moduladores.

Por otro lado, se pueden los ionoforos para registros que deban ser realizados sin comprometer el medio intra-celular. Sin embargo, es una metodología compleja que necesita de condiciones especiales ya que son altamente fotosensibles.

Sampleo y filtrado

Hoy en día las corrientes se registran en digital y podemos determinar la frecuencia de sampleo de cara a la obtención de los datos. Por ejemplo, ante una frecuencia de sampleo alta, encontraremos inmensidad de puntos. Esto es útil por que dependiendo de esta frecuencia mencionada, la complejidad del procesamiento posterior será de distinta dificultad. Ante registros de canales únicos, será beneficioso sampleos muy grandes por que la corriente obtenida es más bien pequeña y la posibilidad de perder información es alta. Ante whole-cells donde registramos inmensidad de canales, será mejor opción elegir frecuencias de sampleo más bajas.

Toda señal biológica viene dada por longitudes de onda de ciertas amplitudes. Por ello, el filtrado de la información es útil para extraer las señales que nos son de interés. Cuanto menor sea el ratio entre el ruido y la señal, más nos podemos beneficiar del filtrado. No obstante, debemos ser cautelosos con este fino equilibrio ya que filtrar significa perder información.

• Filtros de paso bajo: Utilizados con alta frecuencia ya que el ruido tiene un rango de frecuencia muy amplio a comparación de las frecuencias de señales biológicas.
• Filtros de paso alto: En el estudio de eventos rápidos.
• Filtros de paso de banda (pass-band): Combinación entre paso bajo y paso alto para dejar un rango de frecuencias bien definido.
• Filtros de muesca (notch): Bloquea un rango de frecuencias selectivas utilizado para filtrar lo que se conoce como «hum noise».

A pesar de todo, aquellos que se llevan acabo offline son los más óptimos.

Otro tipo de registros

La electrofisiología también nos permite registrar la actividad que llega a la neurona post-sináptica en forma de EPSC (Excitatory Post-Synaptic Currents) que reflejaría la liberación sincrónica de muchas vesículas. Sin embargo, también podemos medir lo que denominamos como mini-EPSC que refleja la liberación azarosa de neurotransmisores que siguen un patrón estocástico que nos permitiría calcular ciertos parámetros respecto los receptores post-sinápticos. Por otro lado, también podemos medir corrientes post-sinápticas inhibitorias (IPSC) e incluso conjuntos de IPSC y EPSC. También podemos llevar a cabo registros electrofisiológicos en cultivos autapticos, en slices, en DRG, en animales como la aplysia, in vivo en roedores y una infinidad de combinaciones según las preguntas que nos planteemos.

Determinando la conductancia de un canal

Utilizando configuraciones que nos permitan el registro de unos pocos canales en forma de corrientes microscrópicas, podemos calcular la conductancia que presenta un canal. Esto se puede llevar a cabo gracias a la ley de Ohm (V = I x R). Pero, antes de nada, primero debemos tener en cuenta que esta conductancia refleja lo opuesto a lo que entendemos por resistencia.

La resistencia se puede definir matemáticamente como 1 partido por la conductancia del canal (R = 1 / G). Sabiendo este principio, podemos aislar G en la ley de Ohm para sustraer la conductancia que presenta un canal: G = I / V. Por tanto si tenemos ambos valores, a partir de la división de la corriente entre el voltaje, podemos obtener G.

Sin embargo, esto es una simplificación ya que para determinar la conductancia unitaria se debe analizar el ruido no estacionario a partir de diferentes funciones que precisan del cálculo de la varianza en diferentes puntos de la exponencialidad que sigue una corriente microscópica de determinado canal. A partir de este cálculo se traza una gráfica varianza-corriente para reflejar la U invertida donde el pico de la microcorriente corresponde al valor máximo alcanzado por la U. A partir de ello, se puede extraer la conductancia del canal en pico-siemens al igual que la probabilidad.

Esta probabilidad de apertura se realizará a partir de la división del pico de corriente entre la conductancia obtenida multiplacada por N. No obstante, este análisis del ruido permitirá extraer la conductancia media pero no los niveles de subconductancia de un canal iónico.

Conclusión

La electrofisiología es un campo que abarca un gran rango de técnicas que nos permite estudiar la actividad eléctrica del sistema nervioso. El patch-clamp fue un gran avance en cuanto al estudio del comportamiento de los canales y de las neuronas a partir del giga-sello que podemos formar entre la pipeta y la membrana. Esta técnica incluye diversas configuraciones, precisa de un material muy diverso conjunto un exhaustivo análisis posterior para extraer información válida y fiable.

Un fuerte abrazo,

Javier